元培为了实现教育救国，对北大进行了整治，使它从封建学府变成一所近代综合新型大学，同时也以坚定行动对新文化运动表现了极大的支持。
1918年第一次世界大战结束后，协约国胜利了，派出20万名华工参战的中国也在其中。北京的学校连着放假三天来庆祝胜利，举国上下沉浸在一片欢乐的海洋中。蔡元培在北京天安门发表了《劳工神圣》的演讲，为知识分子和工农平民打气。然而他对第一次世界大战胜利的乐观态度没能持续太久，又传来了坏消息：在巴黎和会上，中国代表提出废除外国在中国的势力范围、撤退外国在中国的军队和取消“二十一条”等正义要求，但巴黎和会无视中国也是战胜国之一，拒绝了中国代表提出的要求，竟然决定将德国在中国山东的权益转让给日本。此消息传到中国后，北京学生群情激愤，学生、工商业者、教育界和许多爱国团体纷纷通电，斥责日本的无理行径，并且要求中国政府坚持国家主权。在这种情况下，和会代表提交了关于山东问题的说帖，要求归还中国在山东的德租界和胶济铁路主权，以及要求废除“二十一条”等不合法条约。但结果，北洋政府屈服于帝国主义的压力，居然准备在《协约国和参战各国对德和约》上签字。
在巴黎和会中，中国政府的外交失败，直接引发了中国民众的强烈不满，在这样强大的压力下，中国代表最终没有出席巴黎和会的签字仪式。巴黎和会的外交失败成为导火索，1919年5月4日，五四运动爆发了。
1919年5月4日下午，北京三所高校的3000多名学生代表冲破军警阻挠，云集天安门，北京高等师范学校最早到达天安门。他们打出“誓死力争，还我青岛”、“收回山东权利”、“拒绝在巴黎和约上签字”、“废除二十一条”、“抵制日货”、“宁肯玉碎，勿为瓦全”、“外争主权，内除国贼”等口号,并且要求惩办交通总长曹汝霖、币制局总裁陆宗舆、驻日公使章宗祥，学生游行队伍移至曹宅，痛打了章宗祥，北京高等师范学校数理部的匡互生第一个冲进曹宅，并带头火烧曹宅，引发“火烧赵家楼”事件。随后，军警出面控制事态，并逮捕了学生代表32人。天安门前金水桥南边高悬的一副对联引人注目：卖国求荣，早知曹瞒遗种碑无字；倾心媚外，不期章惇余孽死有头。
烧掉赵家楼的学生游行活动受到广泛关注，各界人士给予关注和支持，抗议逮捕学生，北洋军阀政府颁布严禁抗议公告，大总统徐世昌下令镇压。但是，学生团体和社会团体纷纷支持。
5月5日，政府以教育部的名义对蔡元培下令，让他开除闹事学生，徐世昌身边的反对派甚至声称要解散北大。蔡元培马上召集14间学校的校长开会，商量如何营救被捕的学生，还表示愿意一人抵罪。校长团去到教育部和总统府，但被拒绝接见；到了6日下午，蔡元培等人再次去找教育部总长吴炳湘，经过一番交涉，吴炳湘提出禁止学生参加国民大会以及各学校尽快复课的要求，蔡元培答应了，32名学生终于被释放。
在五四运动中北大和政府的对立，导致蔡元培的处境变得非常艰难，于是在5月8日，即被捕学生释放后第二天，蔡元培“引咎”辞职，次日悄悄离京。
离开北京以后，经历了这场风雨的蔡元培觉得身心俱疲，来到杭州修养身心。在杭州的湖光山色中，他感觉非常放松，萌生了下半辈子就过这样寄情山水、著书译书生活的念头。就在这段时间里，他完成了李慈铭《越缦堂日记》的相关整理和出版工作。
蔡元培南下途经天津与一位友人谈话时，他解释辞职的原因,“我之此去，一面保全学生，一面又不令政府为难，如此始可以保全大学。在我可谓心安理得。”5月10日，他在《告北大同学诸君》信中明确表示：“仆深信诸君本月四日之举，纯出于爱国之热诚。仆亦国民之一，岂有不满诸君之理！”
其实在5月9日的晚上，北大就召开了教职员会议，推举李大钊、马叙伦和徐宝璜等人去教育部拜访部长傅增湘，声明蔡元培不仅对于北大来说非常重要，也涉及到教育和外交的前途，希望能挽留蔡元培，否则就要集体辞职。消息传出去以后，当天下午北京12所大学的校长在北大开会，决定上书政府，说明如果不能恢复蔡元培任职的话，他们也都一并辞职，当下就起草好文件后大家一起签了字，第二天呈递给政府。
北京各大专校长见政府对慰留蔡元培始终不表态，5月13日向政府集体递交辞呈，以此支持蔡元培，表明共进退的坚定决心。大总统徐世昌表面文章做足，暗地小动作频频。5月14日，签署慰留蔡元培的命令；同日，将挽蔡命令与挽留“五四运动”矛头直指的陆宗舆、曹汝霖命令一并在《晨报》发表；同日，又下了两道弹压罢课学生的命令，指责学生“名为爱国，适以误国”，要求教育部门约束学生，“毋得干务政治”。5月15日，将同情蔡元培和五四运动的教育总长傅增湘免职。由此可见，与学生“挽蔡”真挚情感不同，北洋政府对蔡元培留任北大校长消极敷衍，毫无诚意。
于是北京各校学生继续罢课，核心诉求三个：中国不在巴黎和约上签字；罢免曹汝霖、陆宗舆、章宗祥；蔡元培复职北大校长。半个月后，全国多个城市罢工、罢市声援，形成运动新**。军阀大肆抓捕上街演讲、游行的学生。罗家伦在《北京大学精神万岁民众革命精神万岁》）描述：北大三院“校舍化作军营，被捕的一千一百余人之中，北京大学学生占六百余个”。
法不责众，何况已引起公愤。北洋政府的监狱关不了这么多爱国学生，只好不了了之，释放被拘禁在北大三院的学生。在北大师生、全国教育界工商界、社会舆论的持续联合压力下，北洋政府被迫继续让步。6月10日，下令免曹、陆、章三人之职。6月26日，主持教育部部务的傅岳棻致电在杭州隐居的蔡元培，不接受辞呈，“学府主持，非公莫属。众望所在，翘企同殷。”同时专门派徐秘书抵杭劝说，以表挽留诚意。6月28日，中国代表团拒绝在《凡尔赛和约》上签字。
6月22日，北京教联、学联、学生代表还有教育部都派出代表专门去杭州迎接蔡元培回来。在盛意拳拳之下，蔡元培再也没法拒绝，这才同意回到北大。7月9日蔡元培复电傅岳棻，留任北大校长，以胃病未愈为由，未立即北上，期间暂由蒋梦麟代理校长职务。7月11日，《时事新报》刊登蔡元培复任两条件：（一）不参加校外会集；（二）今后学生行动听指挥。所谓“听指挥”，即希望学生不仅要尽快复课，而且不能随便罢课。
两个月后，蔡元培的胃病有好转，他回到北大办公，得到了全校师生的热烈欢迎，他也在会上作了答谢演讲。在这之后，蔡元培提出进一步完善学校体制的要求，目的是即使他不在也不至于影响校务正常进行。
1922年3月，蔡元培提出了教育独立说，主张教育应当独立于政治和宗教。当时他参考法国的教育体制，把全国划分为几个大学区，由各所大学的教育委员会主持事务；经过高等教育会来选举教育总长，不受政党因素的限制；在教育经费问题上参考美国，除了贫困地区由政府补助，其他地区从本区直接抽税。虽然他竭力想为中国教育谋求新的出口，但这些改革在当时的时局下效果并不大。