蔡元培从日本回国后不久，南洋公学就爆发了一起大学潮运动。
事情发生在1902年11月14日，五班的学生伍正钧误把一个墨水瓶放在了南洋公学思想保守的校教务长郭振瀛的桌上，郭振瀛顿时大怒，他认为这是学生故意在讽刺他“胸无点墨”，当场大声斥骂伍正钧不尊重师长。事情闹大了以后，学校宣布开除伍正钧，还要给班上所有的学生记大过的处分。全班同学无法接受这种决定，去找学堂总办汪凤藻，要求辞退郭振瀛并收回开除和处分的决定，但被汪凤藻拒绝了。11月15日，这个班的学生决定全班退学。学堂总办还以“五班学生聚众开会，倡行革命，着全体一律开除”的内容发出公告，一时间引起全校学生不满，200多名学生以罢课抗议，声援五班。
蔡元培被派去处理这件事情，但他发自内心地同情学生，认为他们能够学有所成才是当前最重要的事情，所以召集特班的学生，建议大家自动组织起来，扩大容量，再去招募更多有志求学的学生来更好地进修。学生们坚决要求学校收回成命，并退一步愿意等到第二天早上十点；但学校寸步不让，于是在第二天的下午中院6个班加上特班的学生一共两百多人，一路高呼“祖国万岁”的口号，列队离开。最终，145名学生从南洋公学退学。这就是历史上有名的南洋公学学生退学风潮，史称“墨水瓶事件”。
为什么会发生这样的事情呢？前面我们讲到，南洋公学的课程设置虽然是一流的，但学校政务制度仍然专制又守旧。因此，学生们在新思潮的影响下早已萌发的自由意识与专制制度产生了矛盾，最终导致了这次大学潮运动。蔡元培在这次公开的抗争中，站在了学生们正义的一方，他出面跟当局交涉，希望能改变对学生们的处分，但未能成功。于是蔡元培与学生们共进退，也毅然辞职离开了南洋公学。
说到当时的背景，在1900年的庚子赔款后，大批文人志士在上海办报兴学，展开反清活动。蔡元培在这个期间也开始踏上革命之路，正是在这短短的三四年时间里，改变了他一生的政治归属。1903年上半年，蔡元培开始主持爱国学社。爱国学社跟一般的教学机构不一样，主要是模仿日本明治维新领导人西乡隆盛等人提出的“重在精神教育”的办学理念，来激发学生们的革命志气。在这里凡事都是大家商量着来，社员以“联”为单位，每一联有20多人，学生们可以任意组合。蔡元培在爱国学社创办时慷慨激昂地致辞说道：“希望同学们努力学习，用学到的知识、思想普及全国，就像神经联系着脑筋而遍布全身一样。学社如果能有这样的希望，那么中国的前途，就会因你们而有希望了。”
当时，爱国学社中的老师们大部分也是义务教学，他们一般都有其他的经济来源，不需要靠学社的工资来维持生计。在课程安排上，蔡元培负责讲授伦理课程，吴稚晖讲授天演论，章太炎教高级国文，何海樵、何山渔担任体育老师，英语教员由外籍女教师担任，等等。
蔡元培为学社的创办付出了许多努力，学社刚创办时因为经费不足，运营非常困难，甚至穷到连吃饭的钱都拿不出来。当时蔡元培的长子阿根病重，但他因为学社筹款的事情要到南京去找政治思想家蒯[kuǎi]光典求助，就在他匆匆前往南京筹款，刚到码头的时候，家人就来报信说阿根已经病亡，他顿时泪如雨下。蔡元培委托中国教育会的同事办理后事，还是登上了开往南京的轮船。三天后，他带着借来的6000元办学经费回到上海。为了维持学社的运营，后来学社和《苏报》达成合作，由教员们写稿来获得资金支持，这也减少了学社的经济压力。
1903年4月，南京江南陆师学堂的31名退学学生在蔡元培的鼎力相助下加入了爱国学社；同年被浙江杭州求是大学堂无理开除的80多名学生退学后，也想仿效爱国学社自建民塾，所以邀请蔡元培进行指导，但蔡元培因为太忙无法到现场，只能在《苏报》上撰文表示支持。当时爱国学社的规模和影响力都日渐增大，在读的学生已经增加到150多人。随着学社影响力的增强，也逐渐收到一些捐款以维持运营。爱国学社在当时兼任了教学和革新的双重任务，是时代趋势下应运而生的产物，几乎算是国内唯一的革命机关了。蔡元培率领学生举行革命演说，评论时事政治，发表政治意见，对这时期的社会发展产生了积极的影响。
之后，蔡元培怀揣满腔爱国热情，继续投入革命工作。当时广西巡抚王之春为了平定境内的叛乱，上奏清政府让法国派军队镇压，还因为这件事向亨达利洋行借款，承诺事成之后以广西路矿作为酬谢。在东京的留学生听到这个消息后非常愤怒，要求清政府严惩王之春，同时请爱国学社进行支持。得到消息后，蔡元培第二天就在张园聚会上发表演说，大声呼吁：“这不仅仅是一两个省的事，而是全国人民的事！大家要团结起来，为阻止法兵的干涉而需要专门建立一个团体。”还指出，外国干预就是亡国的原因，广东和广西的沦陷只是一个开始，绝对不能继续下去。接着他率领学社成员，迅速投身到抗法运动中去。
不久以后，又发生了拒俄运动。俄国早在三年前就入侵我国，但在《辛丑条约》签订后并没有从我国撤兵。1902年清政府又跟俄国签订了《中俄交收东三省条约》，规定俄军要从东北境内撤军，但军队还没撤出，1903年俄军又违反条约提出新要求，企图继续霸占东北。这引起了国民的极大不满，新一轮的拒俄运动就此发生。4月下旬，蔡元培率教育会和学社成员参加了拒俄大会，揭露沙俄的罪行，探讨革命方法。在4月30日的拒俄大会上，参会人员达到了1200多人，蔡元培等人在会上演讲，全场齐唱《爱国歌》，气氛相当热烈。在大会进行的过程中，收到留日学生的电报，表明留学生团体已经结成义勇队愿上前线作战，希望能得到协助。现场有人倡议大家从原地向东鞠躬，用来表明对留日学生爱国之心的支持。这句话话音刚落，蔡元培就带头朝东鞠躬来表达自己的支持之心，现场洋溢着满满的爱国**。
随着学社工作的蓬勃开展，蔡元培更进一步地认识到，只搞演说这些活动是不够的，需要更实际的革命活动。之后爱国学生们也仿效东京留学生成立了抗俄义勇队，进行军事操练。本是长袍马褂的蔡元培毅然剪去辫子，脱掉长袍，积极投身参与活动。
学社工作开展得如火如荼，清政府对蔡元培等人的爱国活动却开始极度不满，清朝驻沪大臣吕海寰还下令要缉拿蔡元培、吴稚晖等人。